La muestra disuelta se hace pasar a alta presión por una columna rellena de partículas muy finas. Cada componente interactúa con ese relleno con distinta intensidad y sale de la columna en un momento diferente, su tiempo de retención. Un detector —en péptidos, casi siempre ultravioleta a unos 214-220 nm, donde absorbe el enlace peptídico— registra cada componente como un pico.
El resultado es el cromatograma. La pureza se calcula dividiendo el área del pico principal entre el área total de todos los picos. Un «≥99% por HPLC» significa que, en esas condiciones, el 99% de lo que el detector ve es el péptido principal.
En péptidos se usa sobre todo la HPLC de fase inversa (columna C18 y un gradiente de agua y acetonitrilo con un modificador ácido). La calidad del método importa: una impureza que sale al mismo tiempo que el pico principal no se ve, por eso los métodos se optimizan y se complementan con espectrometría de masas.
La pureza por HPLC dice cuánto del material es el péptido correcto frente a otros péptidos parecidos, pero no dice cuánto péptido hay en el vial (eso es el contenido peptídico) ni confirma por sí sola su identidad (eso lo hace la masa).
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